本发明公开了一种梯度矿化骨细胞外基质材料及其制备方法，本发明对天然组织来源的骨组织进行免疫原性去除处理，即脱细胞化，将获得的脱细胞骨进行梯度脱矿处理；获得梯度矿化骨细胞外基质材料。本发明扩大了骨基质材料的孔隙率及其表面胶原的暴露程度，有效释放生长因子，很好的提高了材料对细胞粘附度，调控细胞再生相关基因和蛋白上调。不仅很好的保留了天然骨ECM支架的生物力学特性和三维微观结构，更重要的是对成骨、血管生成以及骨折初期胶原矿化起到了积极作用，增加了细胞的定植粘附，促进了细胞的分化诱导。天然组织来源的梯度矿化骨细胞外基质材料在促进间充质干细胞分化和成骨方面比未脱矿或完全脱矿骨基质材料表现出更大的潜力。